主要仪器数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器。主要试剂氯化镉（CdCl2·2.5H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批号20080901。使用时用去离子水配制成不同浓度。正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，溴化乙锭（EB）。氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚砜（DMSO），盐酸（HCl）等，均为国产分析纯试剂。主要溶液的配制磷酸缓冲液（PBS）NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，KH2PO40.2g，无Ca2+、Mg2+双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4℃保存备用。0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）0.5gNMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。0.5%低熔点琼脂糖（LMA）0.5gLMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。细胞裂解液精确称取NaCl146.1g，Na2EDTA37.2g，N-十二烷基肌氨酸钠10g，Tris1.22g，放入1000ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁力搅拌溶解（可加热），以4mol/LNaOH调pH到10.0，在容量瓶中加水定容到1000ml。冰箱4℃保存备用。临用前根据用量按总体积加1%Triton-X-100，10%DMSO混匀。碱性电泳缓冲液Na2EDTA0.186g，NaOH6g，加500ml双蒸水定容，pH13，现配现用。Tris-HCl中和液称取Tris48.44g，加600ml双蒸水溶解，用浓盐酸（约13.5ml）调pH值至7.5，加水定容到1000ml，4℃保存备用。EB染色液（0.03mg/ml）溴化乙锭（EB）3.0mg，双蒸水100ml，避光4℃保存备用。试验分组染毒单细胞凝胶电泳试验在染毒第40d时，各组小鼠摘眼球取血后打开胸腔，左心室插管，右心耳打一切口，生理盐水快速灌流至动物尸体展开，肢体变硬为止。迅速取肺脏组织，用冰冷的PBS漂洗三次至无血，再用不锈钢剪刀将其剪碎，加适量PBS液到玻璃匀浆器研磨，并过300目不锈钢筛网，得单细胞悬液。然后以5000r/min离心5min，轻轻吸去上层溶液，再加PBS，冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为106～107个/ml，台盼兰染色镜检细胞存活率（细胞存活率90%以上），立即进行以下步骤。（1）胶板的制备①第一层胶的制备：将已预热56℃的80μl0.5%正常熔点琼脂糖NMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）滴到同样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。②第二层胶的制备：取10μl含1000个细胞的PBS和75μl0.5%低熔点琼脂糖LMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37℃混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。③第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85μl预热37℃的0.5%LMA，盖上盖玻片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。（2）细胞裂解移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。（3）DNA碱解旋细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA，使DNA断链，在电泳场中易于迁移。（4）单细胞电泳在25v、300mA条件下电泳20min。（5）中和与染色电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15min。然后每片载玻片上滴加50μl30μg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。（6）试验结果观察与数据处理EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。①每只小鼠的肺组织制一张片子，每张片子随机选择100个肺细胞，计数各组小鼠肺组织的拖尾细胞数，计算拖尾率，并利用统计软件SPSS10.0进行X2检验。②每只小鼠的每张肺组织片子随机选择25个细胞，利用CometAssaySoftwarePect(CASP1.2.3beta1)图像分析软件(http://caspla...
